1、產(chǎn)品介紹
細(xì)胞是生物活動的基本功能單位，也是生命科學(xué)的核心研究對象。生物機(jī)體的組織由多種類型的細(xì)胞組成，每種細(xì)胞類型都有不同的譜系和獨(dú)特的功能，對組織和器官生物學(xué)產(chǎn)生影響，并最終定義機(jī)體整體的生物學(xué)功能。每個細(xì)胞的譜系和發(fā)育階段決定細(xì)胞如何對其他細(xì)胞和微環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答。此外，由于隨時間產(chǎn)生的隨機(jī)變化，同類型細(xì)胞的亞群之間以及它們與其他細(xì)胞類型之間通常具有遺傳異質(zhì)性。若想通過分析大量組織或細(xì)胞來深入了解機(jī)體的這種復(fù)雜性是很困難的，這就突顯出分離單細(xì)胞進(jìn)行研究的必要性。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序指的是在單個細(xì)胞水平上研究基因表達(dá)的一項(xiàng)技術(shù)，其主要技術(shù)原理是每個分離得到的單細(xì)胞內(nèi)包含的微量 mRNA 通過高效擴(kuò)增后再進(jìn)行測序，因此單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序可以有效解決細(xì)胞異質(zhì)性問題，有助于細(xì)分細(xì)胞亞群并發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型，了解細(xì)胞發(fā)育和分化的調(diào)控機(jī)制等。
真正單細(xì)胞測序：10x genomics 技術(shù)原理類似于 Drop-seq，平臺利用微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)分選單個細(xì)胞，通過 barcode 磁珠-單細(xì)胞-油滴的對應(yīng)關(guān)系形成 GEM（Gel Beads-in emulsion），實(shí)現(xiàn)真正意義上的單細(xì)胞測序。
2、應(yīng)用領(lǐng)域
1. 組織器官大規(guī)模細(xì)胞圖譜構(gòu)建；
2. 細(xì)胞分型細(xì)化 & 稀有細(xì)胞類型鑒定；
3. 腫瘤方向研究 ：a) 腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，b) 腫瘤微環(huán)境，c) 腫瘤免疫反應(yīng)，d) 腫瘤進(jìn)化，e) 細(xì)胞受體，配體間相互作用，f) 腫瘤耐藥性，g) 腫瘤干細(xì)胞分化；
4. 干細(xì)胞發(fā)育及分化研究；
5. 免疫研究：a) 構(gòu)建免疫圖譜，b) 免疫細(xì)胞分化，c) 免疫治療；
6. 生物標(biāo)志物挖掘
3、案例分析
案例 1：利用空間組學(xué)技術(shù)解析人結(jié)直腸癌中的多細(xì)胞免疫中心
研究背景：
在結(jié)直腸癌中，錯配修復(fù)缺陷型(MMRd)腫瘤比錯配修復(fù)完整型(MMRp)腫瘤表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤免疫能力。為了了解不同反應(yīng)的規(guī)律，作者采用單細(xì)胞和空間組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對此進(jìn)行了解析。
研究思路：
作者從 28 個 MMRp 和 34 個 MMRd 個體的大腸腫瘤和 36 個鄰近正常組織中轉(zhuǎn)錄分析了 371,223 個細(xì)胞。對 88 個細(xì)胞亞群及其 204 個相關(guān)基因表達(dá)程序的分析顯示，結(jié)直腸癌中存在廣泛的轉(zhuǎn)錄和空間重構(gòu)。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相互作用的惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞的樞紐，作者確定了不同細(xì)胞類型的表達(dá)程序，這些程序在受影響個體的腫瘤中存在共同變化，并使用空間圖譜來定位協(xié)同程序。同時，在腫瘤-管腔界面發(fā)現(xiàn)了一個與組織損傷相關(guān)的髓系細(xì)胞吸引中心，以及腫瘤內(nèi) MMRd 富集的免疫中心，這個免疫中心包含了活化的 T 細(xì)胞以及表達(dá)了趨化因子的惡性腫瘤細(xì)胞和髓樣細(xì)胞。
研究結(jié)果：
本研究提供了一個相對較大的腸癌患者數(shù)據(jù)集，進(jìn)行了包括細(xì)胞狀態(tài)、基因程序及其在腫瘤中的轉(zhuǎn)化(如在間質(zhì)細(xì)胞中觀察到的深刻變化)。作者基于基因程序的共同變異對幾個多細(xì)胞中心進(jìn)行預(yù)測，隨后進(jìn)行兩個免疫-惡性中心（hub 區(qū)域）的空間定位，將大量的細(xì)胞狀態(tài)和程序組成較少數(shù)量的細(xì)胞和過程的協(xié)調(diào)網(wǎng)絡(luò)。了解這些中樞的分子機(jī)制并研究它們在治療過程中的時間和空間調(diào)節(jié)對于推進(jìn)癌癥治療至關(guān)重要。
Karin Pelka, et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer, Cell, Volume 184, Issue 18, 2021, Pages 4734-4752.e20,https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.003.
影響因子：41.582
案例 2：DSP 聯(lián)合單細(xì)胞解析滑膜肉瘤腫瘤免疫微環(huán)境
研究背景：
滑膜肉瘤是一種由 SS18-SSX 基因融合驅(qū)動的惡性腫瘤。該腫瘤的一個特點(diǎn)是腫瘤免疫微環(huán)境中極低的 T 細(xì)胞浸潤程度，因此目前在腫瘤治療領(lǐng)域大展身手的免疫療法在此處也不免折戟。基于滑膜肉瘤的含堿性組織特性，目前關(guān)于滑膜肉瘤的基因組學(xué)和分子致病機(jī)理研究依然依賴于少部分樣本的大塊組織進(jìn)行分析，因此醫(yī)學(xué)界對于其中腫瘤異質(zhì)性和免疫微環(huán)境的了解少之又少。如何通過深入了解滑膜肉瘤中腫瘤細(xì)胞群落和免疫細(xì)胞貧乏的原因?qū)τ趯碓谠摷膊≈凶尭嗖∪耸找嬗诿庖忒煼ㄓ兄钸h(yuǎn)的意義。
研究思路：
1. 單細(xì)胞測序?qū)?12 個滑膜肉瘤的 16,872 個細(xì)胞進(jìn)行了分析并提取了腫瘤細(xì)胞富集的核心驅(qū)動基因標(biāo)記，可區(qū)分上皮和間質(zhì)細(xì)胞（mRNA/CNV/關(guān)鍵融合基因檢測SS18-SSX1/SS18-SSX2）
2. 原位免疫熒光檢測驗(yàn)證核心驅(qū)動基因 KM 生存分析（HSP90、c-Jun、EGR1、LGALS1、E-cad、Vimentin）
3. 通過 DSP 技術(shù)，對 9 例患者 FFPE 樣本中的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組的分析（CTA），2 例開展 WTA 分析，形態(tài)學(xué)試劑為 CD45、panCK 及核染；
研究結(jié)果：
核心驅(qū)動基因 signature 主要集中在 TNF 信號通路、p53 信號通路以及細(xì)胞凋亡的抑制，說明該基因集在免疫抑制和腫瘤細(xì)胞增殖方面可能有著重要作用。應(yīng)用核心基因集對大樣本量滑膜肉瘤病人進(jìn)行生存分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記主要集中于分化更差、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及出現(xiàn)復(fù)發(fā)的病人當(dāng)中，這一發(fā)現(xiàn)對于指導(dǎo)病人預(yù)后具有極大的臨床意義。NanoString 的 GeoMx Digital Spatial Profiler 平臺分析結(jié)果表明，核心驅(qū)動基因標(biāo)記在組織空間中的分布與免疫細(xì)胞的浸潤呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞中的核心驅(qū)動基因標(biāo)記越是富集，周圍的免疫細(xì)胞浸潤越低，說明該核心驅(qū)動基因直接抑制了 T 細(xì)胞的浸潤，令本來具有抗腫瘤活性的 CD8 T 細(xì)胞無法消滅這些腫瘤細(xì)胞。
Jerby-Arnon L, et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nat Med. 2021 Feb;27(2):289-300. doi:10.1038/s41591-020-01212-6. Epub 2021 Jan 25. PMID: 33495604.
影響因子：28.547
4、常見問題
Q1.通常樣品 nGene 和 nUMI 的相關(guān)性系數(shù)要在 0.8 以上，但是這次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性在 0.5以下，怎么解釋這個情況，得到的實(shí)驗(yàn)下機(jī)數(shù)據(jù)還可靠嗎？
影響相關(guān)性的因素有文庫制備過程的穩(wěn)定性和細(xì)胞狀態(tài)的一致性。如果相關(guān)性較低，可能是由于文庫中細(xì)胞狀態(tài)差異較大。可能與細(xì)胞檢測時的狀態(tài)有關(guān)，有些細(xì)胞可能活性降低，核酸存在降解的狀態(tài)。
Q2. 檢測線粒體表達(dá)量目的是為了作為陰性對照嗎？正常線粒體基因在細(xì)胞中含量不是很多，那檢測線粒體表達(dá)量是評價(jià)測序結(jié)果好壞的一個陰性對照嗎？
檢測線粒體基因的表達(dá)量是一個數(shù)據(jù)分析質(zhì)控指標(biāo)。除了部分特殊類型的細(xì)胞（如卵細(xì)胞），如果定位到線粒體的比例高，表明細(xì)胞質(zhì)量較低，這可能是細(xì)胞凋亡增加所致。
高通量測序
NGS
1、平臺介紹
DNBSEQ-T7 基因測序儀、MGISEQ-2000 基因測序儀等儀器所采用的專有 MGI 技術(shù)通過升級流動槽，流體、生化和光學(xué)系統(tǒng)，基于 DNBSEQTM 技術(shù)，4 聯(lián)芯片平臺，支持PE150 和 PE100 不同讀長并行測序，全面升級生化、流體及光學(xué)系統(tǒng)，使測序更加高效多產(chǎn)。帶來了更高的準(zhǔn)確度，并提高了效率。日產(chǎn)出高質(zhì)量數(shù)據(jù) 1-6 T，廣泛適用于全基因組測序、超深度外顯子組測序、表觀基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和腫瘤 Panel 等大型測序項(xiàng)目。
2、服務(wù)優(yōu)勢
1. 經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員：擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員和自主可控的實(shí)驗(yàn)平臺。
2. 強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)平臺：擁有國際領(lǐng)先的 DNBSEQ-T7、MGI2000 等高通量測序儀器 ，高效、穩(wěn)定。
3. 個性化的信息分析：對于非標(biāo)準(zhǔn)信息分析要求，可根據(jù)客戶需求制定個性化信息分析方案，信息分析專人跟進(jìn)，確保滿足客戶需求。核酸蛋白質(zhì)緊密結(jié)合：依托于一流的檢測平臺，將核酸、蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，提供一站式完整服務(wù)，為生命學(xué)研究提供有力支持。
3、產(chǎn)品簡介
4、常見問題
Q1. 人基因組部分區(qū)域 GC 含量過高對重測序有什么影響？
由于化學(xué)本質(zhì)的問題，GC 含量高、擴(kuò)增困難、偏差大，從而引起測序偏差。因此，一般高 GC 區(qū)域的平均深度較整個基因組的平均深度要低。另一方面，高 GC 也影響酶擴(kuò)增時的準(zhǔn)確性，即高 GC 可能提高擴(kuò)增時的錯誤率，短讀長測序本身也是一種合成/擴(kuò)增，因此也會提高錯誤率，導(dǎo)致整條序列的錯誤率提高，錯誤率越高，reads 比對時就有可能比對到錯誤的位置，或者比對不上。
Q2. 測序深度的意義是什么？
測序深度是指測序得到的堿基總量占基因組小大的比值，測序深度越高，測序結(jié)果越準(zhǔn)確，后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析也就越準(zhǔn)確。如果做腫瘤、低頻突變的研究，建議測序深度至少達(dá)到200X 以上。如果只看經(jīng)典 SNP、非低頻突變，測序深度至少也應(yīng)該在 50X 以上。
Q3. 轉(zhuǎn)錄組高通量測序有什么優(yōu)勢？
轉(zhuǎn)錄組是直接對樣本 mRNA 進(jìn)行測序，能夠發(fā)現(xiàn)很多新的 mRNA，轉(zhuǎn)錄組測序?qū)虮磉_(dá)上調(diào)或下降的檢測范圍可以達(dá)到幾萬倍，而且在有參考基因組的情況下，通過轉(zhuǎn)錄組測序還可以分析可變剪接、基因結(jié)構(gòu)變異、全基因組水平基因表達(dá)豐度等情況。
Q4. 什么是長鏈非編碼 RNA？他們的作用是什么？
哺乳動物基因組序列的約 5%-10%被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)編碼基因僅約占 1%，其余 4%-9%的序列都轉(zhuǎn)錄為非編碼 RNA。而非編碼 RNA（non-coding RNA）是指不能翻譯成蛋白質(zhì)的功能性 RNA 分子。長鏈非編碼 RNA 為這 4%-9%中長度大于 200nt 的非編碼 RNA。他們的作用主要體現(xiàn)在 4 個方面，①影響周邊基因的表達(dá)；②調(diào)控蛋白質(zhì)活動和定位；③產(chǎn)生小分子 RNA；④對其他 RNA 的調(diào)控作用。
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